محیط کشت (Culture Medium) به ترکیبی از مواد مغذی گفته می‌شود که شرایط لازم برای رشد، تکثیر و نگهداری میکروارگانیسم‌ها، سلول‌های گیاهی، حیوانی یا انسانی را در شرایط کنترل‌شده فراهم می‌کند. طراحی دقیق یک محیط کشت با هدف تأمین نیازهای متابولیکی موجودات هدف انجام می‌شود و می‌تواند شامل منابع کربن، نیتروژن، ویتامین‌ها، مواد معدنی، فاکتورهای رشد و بافرهای تنظیم‌کننده pH باشد.
بسته به نوع کاربرد، محیط‌های کشت به انواع مختلفی همچون محیط‌های جامد، مایع و نیمه‌جامد تقسیم می‌شوند و در زمینه‌های متعددی از جمله میکروبیولوژی، بیوتکنولوژی، کشت سلولی و تولید داروهای زیستی مورد استفاده قرار می‌گیرند. انتخاب صحیح محیط کشت تأثیر مستقیمی بر نتایج تحقیقاتی و صنعتی دارد و می‌تواند رشد انتخابی یا تفکیکی انواع خاصی از سلول‌ها یا میکروب‌ها را امکان‌پذیر سازد. امروزه با پیشرفت‌های فناوری زیستی، محیط‌های کشت تخصصی و ترکیبی توسعه یافته‌اند که به بهینه‌سازی فرآیندهای کشت در مقیاس‌های آزمایشگاهی و صنعتی کمک شایانی می‌کنند.
ترکیبات رایج محیط کشت
| ترکیب | نقش و کاربرد در محیط کشت |
| پپتون (Peptone) | منبع تأمین کربن و نیتروژن برای رشد میکروارگانیسم‌ها |
| عصاره گوشت گاو (Beef extract) | منبع غنی از اسیدهای آمینه، ویتامین‌ها و مواد معدنی ضروری |
| عصاره مخمر (Yeast extract) | تأمین ویتامین‌ها، کربن و نیتروژن برای بهبود رشد سلولی |
| آب مقطر (Distilled water) | حلال اصلی برای حل شدن ترکیبات محیط و تأمین رطوبت لازم و منبع تامین هیدروژن و اکسیژن |
| آگار (Agar) | عامل جامدکننده محیط کشت برای فراهم کردن بستر رشد سطحی |
فرایند آماده‌سازی محیط کشت
۱. انتخاب نوع محیط کشت
در اولین مرحله، باید نوع محیط کشتی که مناسب هدف آزمایش است، انتخاب شود. محیط‌های کشت می‌توانند عمومی، انتخابی یا تفکیکی باشند که بسته به نوع میکروارگانیسم یا سلول مورد نظر تعیین می‌شود. به عنوان مثال، نوترینت آگار یک محیط جامد متداول برای کشت و جداسازی طیف وسیعی از میکروارگانیسم ها می باشد و برای قارچ‌ها و مخمر ها و باکتری های فیلامنتوس از سابرو دکستروز آگار استفاده می‌شود. انتخاب محیط کشت صحیح تاثیر مستقیم بر رشد، تکثیر و نتایج نهایی آزمایش دارد. در این مرحله دقت به فرمولاسیون محیط کشت بسیار اهمیت دارد.
۲. وزن‌کشی ترکیبات
پس از انتخاب محیط کشت مناسب، ترکیبات تشکیل‌دهنده آن باید با دقت بر اساس دستورالعمل استاندارد وزن شوند. این ترکیبات معمولاً شامل پپتون، عصاره گوشت، عصاره مخمر، نمک‌ها، آگار و سایر افزودنی‌های ویژه است. دقت در وزن‌کشی مواد به درستی عملکرد محیط کشت کمک می‌کند و از بروز خطاهای آزمایشگاهی جلوگیری می‌کند. برای این کار از ترازوی دقیق آزمایشگاهی استفاده می‌شود. وزن ترکیبات باید بر مبنای مقدار محیط مورد نظر (مثلاً یک لیتر) محاسبه گردد.
۳. حل کردن مواد در آب مقطر
پس از وزن‌کشی، ترکیبات در حجم مشخصی از آب مقطر تمیز و عاری از آلودگی حل می‌شوند. برای تسهیل در حل شدن مواد، محلول باید به آرامی هم زده شود و در صورت نیاز حرارت داده شود. استفاده از آب مقطر برای جلوگیری از ورود ناخالصی‌های معدنی یا میکروبی ضروری است. برخی محیط‌ها ممکن است به زمان بیشتری برای حل شدن کامل نیاز داشته باشند. در این مرحله باید اطمینان حاصل شود که هیچ ذره جامدی در محلول باقی نمانده است.
۴. تنظیم pH محیط
با توجه به اینکه PH یکی از فاکتور های مهم برای تمایز میکروارگانیسم های مختلف است ، تنظیم pH محیط کشت یکی از مراحل حساس در آماده‌سازی است که باید قبل از استریل کردن انجام شود.
برای مثال در محیط کشت سابرودکستروز آگار PH اسیدی ( حدود 5) از رشد باکتری‌ها جلوگیری می‌کند و امکان رشد مخمرها و قارچ‌های رشته‌ای را فراهم می‌کند. این امر موجب می‌شود تا این محیط کشت به عنوان یک محیط کشت انتخابی در نظر گرفته شود.
اما معمولاً pH محیط کشت‌ها در محدوده خنثی یا کمی قلیایی (حدود ۷.۰) تنظیم می‌شود. برای تنظیم pH از محلول‌های رقیق اسید (مثل HCl) یا باز (مثل NaOH) استفاده می‌شود. pH نادرست می‌تواند رشد میکروارگانیسم‌ها را مختل کرده یا نتایج نادرستی ایجاد کند. در این مرحله استفاده از دستگاه pH متر کالیبره شده الزامی است.
۵. استریل‌سازی محیط کشت
پس از تنظیم pH، محیط کشت باید برای از بین بردن تمامی میکروارگانیسم‌های ناخواسته استریل شود. استریل‌سازی معمولاً با استفاده از دستگاه اتوکلاو در دمای ۱۲۱ درجه سانتی‌گراد و فشار ۱۵ PSI به مدت ۱۵ تا ۲۰ دقیقه انجام می‌شود. این فرآیند باعث می‌شود محیط کشت عاری از هرگونه آلودگی شود و برای کشت‌های آزمایشگاهی ایمن باشد. در صورت اضافه کردن ترکیبات حساس به حرارت، این مواد پس از استریل شدن محیط اضافه می‌شوند. رعایت کامل اصول استریل‌سازی برای جلوگیری از آلودگی آزمایش حیاتی است.
۶. ریختن محیط در پلیت یا ظرف مناسب
پس از استریل شدن و زمانی که دمای محیط کشت به حدود ۴۵-۵۰ درجه سانتی‌گراد رسید، باید آن را در پتری دیش یا ظروف کشت مناسب ریخت. ریختن محیط باید در شرایط استریل مانند زیر هود لامینار یا کنار شعله انجام شود. ضخامت مناسب محیط در پلیت‌ها اهمیت دارد تا رشد یکنواخت میکروارگانیسم‌ها تضمین شود. پس از ریختن، باید اجازه داده شود محیط به طور کامل جامد شود. در نهایت، پلیت‌ها یا ظروف باید در دمای مناسب نگهداری شوند تا برای کشت آماده باشند.
محیط کشت تعریف شده چیست؟
محیط کشت تعریف شده (Defined Medium) محیطی است که تمام ترکیبات شیمیایی موجود در آن و مقادیر دقیق هر ترکیب مشخص و معلوم است. در این نوع محیط، محقق دقیقاً می‌داند چه مواد مغذی، با چه غلظتی در محیط وجود دارد. این محیط‌ها معمولاً از مواد خالص مانند گلوکز، نمک‌های معدنی و آمینواسیدهای مشخص ساخته می‌شوند.
محیط‌های تعریف شده برای مطالعات متابولیسم سلولی، بررسی نیازهای تغذیه‌ای و تحقیقات ژنتیکی ایده‌آل هستند. استفاده از این محیط به محققان اجازه می‌دهد تأثیر دقیق هر ماده غذایی را بر رشد سلول یا میکروارگانیسم مورد نظر ارزیابی کنند. چون همه ترکیبات معلوم‌اند، نتایج تجربی قابل تکرار و تحلیل دقیق‌تری خواهند بود. این محیط‌ها اغلب در تحقیقات بنیادی یا پروژه‌های بیوتکنولوژی کاربرد دارند. آماده‌سازی آن‌ها نیازمند دقت بالا در وزن‌کشی مواد و کنترل شرایط است.
| ترکیبات | دقیقاً مشخص |
| کاربرد | تحقیقات متابولیسم، ژنتیک، بیوتکنولوژی |
| مزیت | تحلیل دقیق اثر هر ماده |
| معایب | ممکن است برای رشد برخی از میکروارگانیسم‌ها که به فاکتورهای رشد ناشناخته نیاز دارند، مناسب نباشد. |
| نمونه محیط تعریف شده | محیط M9، محیط Minimal Salts |
| دقت آماده‌سازی | بسیار بالا |
| هزینه | نسبتاً زیاد |
محیط کشت تعریف نشده چیست؟
محیط کشت تعریف نشده (Undefined Medium) محیطی است که ترکیبات آن دقیقاً مشخص نیست و معمولاً حاوی مواد طبیعی مانند عصاره گوشت یا عصاره مخمر است. در این محیط، مقادیر دقیق اجزاء شیمیایی مانند آمینواسیدها، قندها و ویتامین‌ها معلوم نیست. محیط‌های تعریف نشده اغلب برای رشد سریع‌تر و بهتر طیف گسترده‌ای از میکروارگانیسم‌ها استفاده می‌شوند.
این محیط‌ها برای کشت‌های عمومی، تولید انبوه سلولی و کارهای غیرتحقیقی مناسب هستند. چون ترکیبات طبیعی استفاده می‌شوند، این محیط‌ها از لحاظ بیولوژیکی غنی‌تر بوده ولی دقت علمی پایین‌تری دارند. آماده‌سازی آن‌ها نسبت به محیط‌های تعریف شده ساده‌تر و اقتصادی‌تر است. با این حال در تحلیل‌های دقیق متابولیکی کمتر کاربرد دارند.
| ترکیبات | ترکیبات طبیعی، نامشخص |
| کاربرد | کشت عمومی، رشد سریع |
| مزیت | آماده‌سازی آسان و ارزان |
| معایب | نامناسب برای مطالعات متابولیکی دقیق ، تکرار پذیری کمتر نسبت به محیط تعریف شده |
| نمونه محیط تعریف نشده | نوترینت آگار، سابورو دکستروز آگار |
| دقت آماده‌سازی | متوسط |
| هزینه | پایین |
| ترکیبات | ترکیبات طبیعی، نامشخص |
| کاربرد | کشت عمومی، رشد سریع |
محیط کشت پیچیده چیست؟
محیط کشت پیچیده (Complex Medium) نوعی از محیط کشت تعریف نشده است که ترکیبات آن شامل مخلوطی از مواد طبیعی بسیار متنوع و غنی است. در این محیط، موادی مانند پپتون، عصاره گوشت، عصاره مخمر و کازئین به صورت ترکیبی حضور دارند که باعث رشد سریع و قوی‌تر میکروارگانیسم‌های سخت‌گیر یا خاص می‌شود.
چون ترکیبات دقیق محیط پیچیده معلوم نیست، برای بررسی‌های علمی حساس مناسب نیست، اما برای رشد عمومی، تولید آنتی‌بیوتیک‌ها و فرآیندهای صنعتی و تست های تشخیصی مثل تست حساسیت آنتی بیوتیکی کاربرد گسترده‌ای دارد. این محیط‌ها به دلیل غنای تغذیه‌ای بالا، نیازهای پیچیده سلولی را بهتر تأمین می‌کنند. اغلب میکروب‌های بیمارستانی یا محیطی در چنین محیط‌هایی کشت داده می‌شوند. آماده‌سازی محیط‌های پیچیده معمولاً ساده‌تر است اما استانداردسازی نتایج دشوارتر خواهد بود. این محیط‌ها به علت انعطاف بالا در شرایط کشت، در صنایع بیولوژیک بسیار مورد استفاده‌اند.
| ترکیبات | ترکیب پیچیده از منابع طبیعی |
| کاربرد | کشت میکروب‌های خاص، تولید صنعتی |
| مزیت | رشد سریع‌تر، تغذیه کامل‌تر |
| معایب | تکرار پذیری پایین، نامناسب برای مطالعات متابولیکی دقیق
ممکن است حاوی مهار کننده باشد. |
| نمونه محیط پیچیده | محیط LB (Luria Bertani)، محیط BHI |
| دقت آماده‌سازی | نسبتاً آسان |
| هزینه | متوسط |
انواع محیط‌های کشت بر اساس ثبات/حالت فیزیکی
محیط جامد
محیط کشت جامد با افزودن ماده‌ای مانند آگار به محیط مایع ساخته می‌شود که معمولاً غلظتی حدود ۱.۵٪ دارد. این محیط به دلیل قوام بالای خود، امکان جداسازی و شناسایی کلنی‌های میکروبی را فراهم می‌کند. از محیط‌های جامد برای بررسی خلوص نمونه‌ها، جداسازی گونه‌های مختلف و تست آنتی‌بیوتیکی استفاده می‌شود. پس از استریل‌سازی و ریختن در ظروف پتری، این محیط در دمای اتاق جامد می‌شود. محیط‌های جامد به دلیل سهولت در مشاهده شکل، اندازه و رنگ کلنی‌ها کاربرد گسترده‌ای دارند.
این محیط‌ها اغلب در آزمایشگاه‌های میکروبیولوژی بالینی و تحقیقاتی استفاده می‌شوند. جداسازی میکروب‌ها به صورت فیزیکی در این محیط امکان‌پذیر است. نمونه‌هایی از محیط جامد شامل نوترینت آگار و سابورو دکستروز آگار هستند.
| قوام | جامد |
| ماده جامدکننده | آگار (۱.۵٪) |
| کاربرد اصلی | جداسازی و شناسایی کلنی‌ها |
| نمونه محیط | نوترینت آگار، سابورو دکستروز آگار |
| مزیت | مشاهده مستقیم کلنی‌ها |
محیط نیمه جامد
محیط نیمه جامد دارای غلظت پایین‌تر آگار، معمولاً حدود ۰.۳ تا ۰.۵٪ است، که ساختاری نرم‌تر و ژله‌ای ایجاد می‌کند. این محیط‌ها به اندازه‌ای چگال هستند که حرکت سلول‌ها را کند کنند، اما همچنان اجازه مهاجرت را بدهند. بیشتر برای بررسی حرکت (موتیلیته) میکروارگانیسم‌ها و رشد باکتری‌های هوازی و بی‌هوازی به کار می‌روند.
مهاجرت باکتری‌ها در محیط نیمه جامد باعث ایجاد الگوهای خاصی از رشد می‌شود. این محیط معمولاً در لوله‌های کشت تهیه می‌شود و نیازی به پلیت‌های مسطح ندارد. محیط‌های نیمه جامد حساس به شرایط محیطی بوده و باید به دقت نگهداری شوند. توانایی درک قابلیت تحرک سلول‌ها در شرایط آزمایشگاهی ارزش زیادی دارد.
| قوام | نیمه جامد |
| ماده جامدکننده | آگار (۰.۳–۰.۵٪) |
| کاربرد اصلی | بررسی تحرک و مهاجرت سلول‌ها |
| نمونه محیط | SIM medium |
| مزیت | تشخیص موتیلیته میکروب‌ها |
محیط مایع
محیط کشت مایع که به محیط بروث (Broth) نیز معروف است، فاقد هرگونه ماده جامدکننده مانند آگار است. این محیط برای رشد انبوه میکروارگانیسم‌ها، آماده‌سازی کشت برای استخراج DNA یا پروتئین و تهیه واکسن کاربرد دارد. در محیط مایع، میکروب‌ها به صورت معلق رشد می‌کنند و امکان جمع‌آوری آسان برای آنالیزهای مختلف فراهم می‌شود.
برای تهیه محیط مایع فقط ترکیبات مغذی در آب مقطر حل شده و پس از استریل‌سازی مورد استفاده قرار می‌گیرد. معمولاً برای کشت‌های مقیاس بالا یا آزمایش‌هایی که نیاز به بیومس زیاد دارند استفاده می‌شود. سرعت رشد میکروارگانیسم‌ها در محیط مایع نسبت به جامد بیشتر است. نمونه‌هایی از محیط مایع شامل نوترینت بروث (Nutrient Broth) و تریپتیک سوی بروث (TSB) هستند.
| قوام | مایع |
| ماده جامدکننده | ندارد |
| کاربرد اصلی | رشد انبوه میکروارگانیسم‌ها |
| نمونه محیط | نوترینت بروث، تریپتیک سوی بروث |
| مزیت | جمع‌آوری آسان سلول‌ها |
تقسیم بندی محیط کشت از نظر کاربرد و مواد تشکیل دهنده
| نوع محیط کشت | کاربرد اصلی | مواد تشکیل‌دهنده عمده |
| محیط کشت عمومی
(General Purpose Media) |
رشد طیف وسیعی از میکروارگانیسم‌ها | پپتون، عصاره گوشت یا عصاره مخمر، نمک‌ها |
| محیط کشت انتخابی
(Selective Media) |
رشد انتخابی گروه خاصی از میکروارگانیسم‌ها و جلوگیری از رشد دیگران | ترکیبات مغذی + عوامل بازدارنده (مثل آنتی‌بیوتیک‌ها) |
| محیط کشت تفکیکی (Differential Media) | تشخیص تفاوت‌های بیوشیمیایی بین میکروارگانیسم‌ها | ترکیبات مغذی + نشانگرهای pH یا معرف‌های زیستی |
| محیط کشت غنی شده
(Enriched Media) |
رشد میکروارگانیسم‌های سخت‌گیر یا نیازمند مواد خاص | محیط پایه + خون، سرم یا فاکتورهای رشد ویژه |
| محیط کشت کاهنده
(Reducing Media) |
رشد میکروب‌های بی‌هوازی | ترکیبات کاهنده (مثل تیوجلیکولات سدیم)، پپتون، آب مقطر |
| محیط کشت اختصاصی (Specialized Media) | آزمایش‌های خاص، تحقیقات ژنتیکی یا تولید صنعتی | ترکیبات انتخابی خاص، محیط‌های تعریف شده یا پیچیده |
محیط کشت؛ پلی میان پژوهش و پیشرفت علمی
محیط کشت به عنوان بستر اصلی رشد و مطالعه میکروارگانیسم‌ها، سلول‌های گیاهی و جانوری، نقش بی‌بدیلی در پیشرفت علوم زیستی و پزشکی ایفا می‌کند. انتخاب صحیح نوع محیط، بر پایه نیازهای تغذیه‌ای و شرایط فیزیکی مورد نظر، اهمیت بالایی در صحت نتایج آزمایشگاهی دارد. امروزه، بسیاری از محیط‌های کشت به‌عنوان پایه‌ای برای عملکرد دقیق‌تر ابزارهایی چون کیت‌های الایزا (ELISA) و کیت‌های تشخیص سریع به‌کار می‌روند که در مطالعات ایمنی‌شناسی، شناسایی عوامل بیماری‌زا و بررسی پاسخ‌های بیولوژیکی نقش حیاتی دارند.
با توجه به تنوع محیط‌های کشت از نظر ترکیبات، کاربرد و حالت فیزیکی، درک صحیح ویژگی‌های هر محیط برای طراحی آزمایش‌های دقیق و بهره‌گیری از کیت‌های تشخیصی مدرن ضروری است. پیشرفت‌های اخیر در فرمولاسیون محیط‌های تخصصی و تعریف شده، امکان بررسی دقیق‌تر رفتار سلولی و فرآیندهای متابولیکی را در کنار روش‌های حساس تشخیص، فراهم کرده است. در نهایت، توسعه مستمر محیط‌های کشت سفارشی و سازگار با تکنولوژی‌های جدید، مسیرهای نوینی را برای تحقیقات علمی، تولید واکسن‌ها، درمان بیماری‌ها و گسترش فناوری‌های زیستی هموار ساخته است. توجه به استانداردهای آماده‌سازی، استریل‌سازی و انتخاب ترکیبات مناسب، کلید موفقیت در تمامی پروژه‌های علمی مرتبط با محیط کشت، خصوصاً در کنار استفاده از کیت‌های تشخیصی پیشرفته، خواهد بود.
